角膜胶原交联的原理

第一节 历史

20世纪90年代末，角膜胶原交联能够扩张角膜的强度和硬度的理论的出现极大地促进了角膜胶原交联技术的应用。最初，有学者观察到糖尿病患者极少出现圆锥角膜。进一步研究发现，这些患者的角膜中存在蛋白的非酶促糖基化，级糖基化终产物。这一现象以及Seiler等应用紫外光促进角膜纤维发生交联的灵感共同推动了角膜交联这个里程碑式治疗手段的出现和发展。

紫外线核黄素角膜交联技术起源于欧洲。紫外光照射核黄素浸泡过的猪角膜或兔子角膜，通过氧化反应可使角膜胶原纤维发生交联。经过紫外交联处理的角膜不但强度增加70%，而且胶原分子量增大，同时也不易被酶降解。

实际上，在此之前，交联技术在工业、高分子合成材料行业及生物工程中应用已较广泛。因其可使聚合物变硬以及使组织变稳定，所以交联技术早期在医学领域的应用包括人工心脏瓣膜的制备、牙科填充材料的固化等，主要用于提高材料的强度和稳定性。

Seiler、Spoerl、Wollensak等人则利用交联技术能使组织变硬这一特性，将其用于圆锥角膜的治疗，通过增加角膜胶原纤维之间的化学连接，增强角膜基质的硬度和强度，从而控制圆锥角膜或角膜屈光术后角膜异常膨隆等扩张性病变的发展。1998年，他们在德累斯顿眼科临床大学开始了一系列的研究，并在大量研究的基础上创造了CXL标准治疗过程，也被称为德累斯顿标准。

本章主要对角膜交联的原理及适应证，以及利用紫外线和核黄素进行角膜交联手术的一些基本概念进行了探讨。

图2-1所示为世界上第一台用于角膜的紫外光交联仪。(Randleman et al.,2015)]

第二节 基本原理

一、角膜胶原纤维交联的原理及效应

角膜胶原纤维交联是利用核黄素（即维生素B2）作为光敏剂配合紫外光照射治疗进展性圆锥角膜的一种治疗方法，最早由Wollensak等在2003年正式报道。在此之前，已经有部分学者在胶原凝胶和猪角膜中进行了纤维交联的早期探索。

研究者在大量的物理化学材料和处理方法中进行筛选，寻求能够明显增加组织稳固性的组合。一般情况下，圆锥角膜者的角膜抗张力会下降近40%；而纤维交联能够使角膜纤维的生物"坚韧"性增加3倍，且对抗胶原酶消化能力也显著提高。因此纤维交联逐渐在世界范围内广泛应用，现已成为圆锥角膜的主流治疗手段之一。此外，纤维交联在角膜扩张性疾病中的应用也渐有报道。

交联的本质是纤维蛋白等大分子间物理化学连接的增强，产生大分子聚合作用。因此，交联的作用十分广泛，使目标材料变得更为坚硬、易于保存。其最早的应用可追溯至3000多年前的埃及木乃伊。利用紫外光照射的单纯物理性交联见于口腔医学中加固填充材料，以及汽车制造中用于稳定外表涂漆。而化学性交联则见于眼内透镜或眼表面接触镜材料的聚合，以及一些生物假体如人工心脏瓣膜的加固处理，有利于增强其自身稳定性，提高对内源性降解的抵抗力，降低免疫原性。

交联反应也是多种疾病的发病机制之一。例如：

• 晶状体蛋白发生交联可致白内障，晶体变硬，变色发黄，透明度下降
• 随着年龄的增加，赖氨酰氧化酶主导的酶促交联和糖化作用主导的非酶促交联均可增加，引起动脉管壁固化，关节僵硬
• 糖尿病患者中，美拉德反应（Maillard reaction，一种复杂的糖-氨基褐变反应）主导的非酶促交联可引起高级聚糖化终产物（advanced glycaton end products, AGEs），使血管通透性增加

1. 紫外线

紫外线（ultraviolet light, UV）是指波长在200~380nm的太阳光线，按波长不同又包括3类：

• UV-A波长为315~380nm
• UV-B波长为280~315nm
• UV-C波长为200~280nm

到达地球表面的太阳光线（290~2000nm）中紫外线约占13%，其中UV-A占97%，UV-B占3%，UV-C接近于0。生活中，对人皮肤有损伤作用的只有UV-A和UV-B。UV-B照在皮肤上可以促进皮肤产生维生素D。紫外线灯一般是靠UV-C来进行消毒灭菌的。对交联反应而言，需要使用UV-A。

2. 核黄素

在角膜纤维交联中，核黄素作为光敏剂能够使紫外光本身的光氧化效应增强数倍，而波长为370nm的紫外光可使核黄素的能量吸收达峰值。与使用脂肪族类β-硝基醇或京尼平（genipin，又名栀子苷元，一种天然交联剂）进行的化学交联不同，光氧化介导的交联具有空间可限制性，能避免破坏目标交联区域的外围或深层组织。

核黄素分子由一个特有的异咯嗪环系统和一个核糖基侧链组成（图2-2），光敏剂特性主要由前者介导。选择370nm波长的原因是400nm波长左右的紫外光的交联效率较高，而436nm的蓝光对视网膜有潜在损伤。在紫外光作用下，核黄素可在极短时间内分解为光黄素（lumiflavin）和光色素（lumichrome），故核黄素制剂必须保存于避光容器中。

 

依反应区域氧含量的不同，光氧化作用介导的交联反应过程包括缺氧型反应（I型光化学反应）及有氧型反应（II型光化学反应）两大类。正常角膜透明无血管，其氧供主要来自空气，故自角膜上皮向内皮方向存在特有氧分压梯度，即高氧和低氧区并存。因此，在角膜纤维交联反应中，I型和II光化学反应均有发生。

光敏剂核黄素分子吸收紫外光的能量后将被激发至所谓的"三线态"，一个核外电子被激发至更高能级。这种高能量状态的持续时间可接近1s。在缺氧型的I型反应中，处于"三线态"的核黄素分子可直接与胶原蛋白发生反应，传递高能级的核外电子，生成基本产物和超氧负离子(O2​−)等自由基，最终产生过氧化氢(H2​O2​)和羟自由基(OH)。而在有氧的II型反应中，"三线态"的核黄素分子则与基态的氧分子反应，产生单态氧(1O2)和/或少量的超氧负离子(O2-)(图2-2)。

这些活性氧分子（reactive oxygen species, ROS）可进一步与胶原分子反应，使胶原分子和糖蛋白分子间生成新的化学共价键，如同在竹梯中再增加梯级，但此种光化学反应并不产生热量。通过以上反应，交联能够显著加固组织，但同时也有损伤活细胞的可能，尤其是当细胞自身的抗氧化系统如过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等已被消耗殆尽的状态下，进一步交联产生的活性氧分子可能杀死细胞。

二、角膜胶原纤维交联的基本效应

1. 生物力学强度

弹性模量（elastic modulus）可视为衡量材料产生弹性变形难易程度的指标，其值越大，使材料发生一定弹性变形的应力也越大，即材料刚度越大，亦即在一定应力作用下，发生弹性变形越小。

一条长度为L、截面积为S的金属丝在力F作用下伸长△L，其中：

• F/S称为应力，其物理意义是金属丝单位截面积上所受到的力
• △L/L叫应变，其物理意义是金属丝单位长度所对应的伸长量
• 应力与应变的比即为弹性模量

弹性模量包括杨氏模量、体积模量、剪切模量等，其中杨氏模量（Young's modules）又称为杨氏弹性模数，或拉伸模量（tensile modulus），是多种弹性模量参数中最常用的一种。它是沿纵向的弹性模量，表征在弹性限度内固体物质材料抗拉或抗压特性，一般用E表示。根据胡克定律，在物体的弹性限度内，应力与应变成正比，比值被称为材料的杨氏模量，它仅取决于材料本身的物理性质。杨氏模量的大小标志了材料的刚性，杨氏模量越大，越不容易发生形变。

众多基础与临床研究均显示交联能够显著增加生物力学强度（图2-3）。使用计算机控制的生物材料检测系统，其应力-应变测量显示交联后，猪角膜和人角膜产生8%应变所需的应力分别增加了71.9%和328.9%，杨氏模量分别增加了1.8倍和4.5倍。

一项兔活体实验显示交联后8个月杨氏模量仍较术前增加78.4%~87.4%，说明交联的生物力学效应稳定而显著。但交联反应的时间过长（如60min），却可使猪角膜的刚性下降。此外，交联的最大效应深度不超过300μm。有趣的是，交联后猪角膜的面波速度可增加20.17%，提示其刚性增加；再对猪全眼球进性膨胀系数检测，可推导出其角膜刚性增加了1.58倍。交联可使胶原蛋白凝胶的杨氏模量增加20%。近年的研究显示，交联增加的仅仅是纤维分子及纤维束之间的连接，对纤维板层间黏附力没有作用。交联对生物力学强度的作用还将在后续章节详述。

图 2-3 交联对角膜组织生物力学强度的影响（左图中，上方为交联后猪角膜，呈黄色，不易软化下垂；下方为未交联角膜，在重力作用下自然下垂。右图中，左侧为未交联猪角膜，放置于平面上时角膜可见皱缩纹路；而右侧的交联角膜中央区十分平整，没有皱缩纹路）（Wollensak et al, 2003）

2. 热稳定性

交联提高了胶原纤维的收缩温度。在猪角膜的热力学实验中：

• 未交联角膜的最高热收缩温度仅为70℃
• 用紫外光核黄素交联者为75℃
• 用戊二醛交联者为90℃

这表明收缩温度依赖于纤维交联的程度。对非交联的胶原纤维进行热变性，在病理切片中可发现其双折射现象消失。

3. 生物化学特性

众多生物化学因素均可影响交联的效果。凝胶电泳可显示交联后的猪角膜中存在分子量至少1000kD的巨大分子，间接证实了交联对胶原蛋白a链和β链的连接效应。

单态氧分子是II型光化学反应介导交联反应的关键分子：

• 若使用叠氮钠阻断单态氧，则紫外光核黄素交联提高兔角膜生物力学强度的幅度仅为20.8%，标准交联下为67%
• 相反，若人为加入氧化氘氘（D2O）延长单态氧的半衰期，则生物力学强度增幅为145.25%

从这个实验可以看出，即使完全阻断单态氧，兔角膜的生物力学强度增幅为20.8%，标准交联下为67%。相反，若人为加入氧化氘氘（D2O）延长单态氧的半衰期，则生物力学强度增幅为145.25%。从这个实验可以看出，即使完全阻断单态氧，兔角膜的生物力

学强度仍有所提升，故I型光化学反应确实在角膜交联中也发挥一部分作用。

使用季铵盐或二硝基苯腙腙清除羰羰基化合物，交联只能增加30%左右的角膜生物力学刚性。若使用乙酰亚胺酸乙酯阻断胺类物质，则生物力学刚性只增加23%，标准交联下为67%。因此，羰羰基化合物和胺类可能在交联反应中共同发挥作用，如组氨酸、羟赖氨酸、酪氨酸等。Brummer等发现高级聚糖化终产物AGEs的抑制剂能够显著降低角膜交联的效应。上述数据表明角膜交联十分依赖羰羰基化合物，同时也涉及AGEs介导的交联反应。在早期研究中已经发现，紫外光核黄素交联的缺氧I型反应中生成了二聚酪氨酸(di-tyrosine, DT)的连接键。若用超微型氧分压传感探针在猪角膜中进行测量，可以发现在紫外光照射15s后，基质内的氧含量迅速下降，这表明I型反应在角膜交联中起主要作用。此外，Zhang等发现胶原分子之间，蛋白聚糖核心蛋白之间，以及一部分胶原分子和蛋白聚糖核心蛋白(如基质聚糖、基膜聚糖、核心蛋白聚糖等)之间均存在交联现象，故并非只有胶原分子发生了交联，一部分蛋白聚糖也参与其中。

交联可提高组织对胶原酶的抗性。交联后的猪角膜可在胶原酶溶液存在15天，而非交联者仅为6天。此外，角膜前半基质的抗性显著高于后半基质。此种抗性的增强有利于对抗具有溶解胶原作用的基质金属蛋白酶，后者已被证实在圆锥角膜中表达过高，是圆锥角膜发病的重要因素之一。

4. 角膜通透性

交联能降低角膜通透性。在猪角膜中若使用化学交联剂丙酮醛，则其对荧光物质的通透性平均降低71%。同样，交联能够降低一些抗生素药物的通透性，高效液相色谱检测显示降低幅度为15%~28%。

5. 抗水肿效应

交联能降低交联密集区域的角膜基质发生水肿的趋势。Wollensak等研究发现，在交联过的猪角膜中，中央重度交联区域存在大量无水肿膨胀的纤维，其无水肿区深度可达242μm；在轻度交联的中周部角膜，无水肿区深度为109μm，其水肿系数为2.2；在未交联的后1/3基质，水肿系数高达2.7。水分向基质内聚的过程可被纤维间新产生的大量连接阻断。对大泡性角膜病变者进行交联，其角膜前基质的胶原纤维区变得十分致密。交联的抗水肿效应还将在后续章节详述。

6. 抗感染效应

交联可通过一系列机制预防和治疗一些感染性角膜病，效果显著。Martin等在众多体外实验中展示了紫外光核黄素交联的抗感染效果。交联的抗感染效应将在后续章节详述。

三、交联后的角膜重塑

使用0.75~4mW/cm²的紫外光能量配合核黄素对兔角膜进行交联，术后24h即可观察到一种迟发型的基质细胞凋亡，凋亡发生的深浅与紫外光能量的高低有关。用3mW/cm²的标准能量交联，基质细胞凋亡深度平均为300μm。基质细胞凋亡后，在原基质细胞的位置及附近将形成微小水肿腔隙。实际上，活体组织分析和体外细胞实验均测算出产生基质细胞破坏的紫外光能量阀值仅为0.5mW/cm²。前部基质细胞凋亡后，后部及周围的基质细胞将移行并重新分布于前部基质，这一过程发生于术后1至3个月内。角膜内皮细胞则更为脆弱，其损伤的紫外光能量阀值仅为0.36mW/cm²。因此，在厚度较低的角膜(基质厚度低于400μm)进行标准交联，紫外光可能穿过基质全层而波及内皮细胞。在兔角膜尚可观察到交联区域在术后3天出现神经纤维的变性，而术后7天即可观察到神经再生。

活体共聚焦显微镜均良好地显示了兔和人角膜交联后的基质创伤修复过程，与体外研究结果基本相符。在人角膜，上皮的愈合在术后5天即可完成，术后1月可观察到上皮下神经丛的再生。基质细胞的早期凋亡，以及弥散的蜂房样肿胀结构一般发生在320~350μm深度。基质细胞的重分布和水肿的消退则在术后3月之后。需要注意的是，由于早期交联仪紫外光发射面为平面式，而角膜呈弧形，故周边角膜的交联反应深度不及中央角膜。较新型交联仪多已根据角膜弧度进行了特殊设计，各向照射深度差异不大(见本章第三节)。另外，一般情况下，内皮细胞无变化。

在紫外光核黄素交联后的兔角膜前部基质，其胶原纤维的直径显著增加了12.2%，达到3.96nm，而后部基质的纤维直径仅增加4.6%，为1.63nm。人角膜及其他组织中也观察到交联的类似效果。用I型胶原蛋白的抗体进行染色，可观察到交联后角膜前部基质变得极为致密，但同时交联区域的自发荧光也增强了，原因并不清楚，可能是交联本身的效应或残留的核黄素分子所致。术后早期，在裂隙灯下观察或使用前节光学相干断层扫描仪(anterior segment optical coherence tomography, AS-OCT)进行扫描，均可观察到发生交联的前部基质密度较高，呈半透明区，与未发生交联的后部基质间存在一条明显的“分界线”，导致部分患者在术后早期出现“眩光感”。从组织学分析推测，前部半透明状态可能与基质细胞凋亡后形成的周围微小腔隙所造成的光线散射有关。在共聚焦显微镜下观察，“分界线”表现为高反光的线性结构，可能是逐渐向上皮方向移动的活化基质细胞。通过前节OCT等方法，可观察到这些前基质的半透明区在术后3至6个月时将逐渐恢复透明，分界线也逐渐自行消失。

四、安全性

在角膜交联反应中，核黄素具有双重作用，它既作为光敏剂参与光氧化过程，又可吸收过多的紫外光进而保护深部基质和内皮细胞。紫外光实质上对人眼是潜在的威胁，但紫外光引起的大多数损伤(如电光性眼炎等)为短波紫外光UV-B所致。正常状态下，UV-B(波长为290~320nm)主要被角膜上皮吸收(如雪盲的形成)。长波紫外光UV-A(波长320~400nm)则可通过正常角膜，但晶体可大量吸收UV-A，进而保护视网膜。这类情况将在后续章节进一步阐述。

从事交联手术的医师的自身安全性也已评估。在手术过程中，到达术者眼部的UV-A能量仅为3.4×10⁻¹¹mW/cm²。此外，手术衣、橡胶手套和紫外光防护镜还可再减少95%～99%的能量。因此，角膜交联的手术操作对术者而言是十分安全的，尚未见术者职业性损伤的报道。

第三节 常见交联设备及药品

角膜交联离不开紫外光发射设备和光敏剂核黄素。最早的角膜交联系统在1996年的美国视觉与眼科学研究协会大会(The Association for Research in Vision and Ophthalmology，ARVO)上首次出现在大众面前。近20年过去了，众多的角膜交联设备和核黄素不断面世，百花齐放，各种不同参数和药品的组合显示了交联技术的精彩。然而在我国，交联设备进入眼科领域仅数年时间，其临床应用迄今尚未得到卫生部正式批准，此类产品仍以临床研究的姿态存在，且种类不多。本章简单介绍数种国内临床常见的角膜交联仪及相应核黄素。

一、UV-X1000型交联仪

UV-X 1000型角膜交联仪由瑞士IROC公司在2006年推出用于临床(图2-4)。这套设备由角膜交联技术的开拓者Theo Seiler和Eberhard Spoerl所在的研究机构开发。这一设备的原理很简单，即将紫外光聚焦在角膜的同一光学平面上，其专利的均一光照技术是交联过程安全有效的关键。实际上，该设备产生的紫外光到达角膜前，其能量参数已根据角膜的曲线进行了预补偿，可以大大减少反射所致的能量丢失和照射区域的形变。

IROC公司生产相应的核黄素产品，包括Innocross-R等渗性核黄素(0.1%核黄素磷酸盐及20%右旋糖酐T500)，以及Innocross-R低渗性核黄素(0.1%核黄素磷酸盐)(图2-4)。两种核黄素均为2mL，保存于注射器中，术中直接滴用。低渗性核黄素的使用详见第七章。

UV-X 1000型交联仪的部分参数特点:

• 波长, (365±10) nm
• 照射强度, 3.0mW/cm²
• 标准照射距离, 5.0cm
• 照射模式，连续式
• 照射时间, 30min
• 光斑直径，S挡7mm，M挡9mm，L挡11mm
• 患者体位, 仰卧位
• 工作电压，100~240V
• 发射器大小, 32cm×5cm×5cm
• 系统重量，6.5kg，光源重0.6kg

二、UV-X2000型交联仪

UV-X 2000型交联仪在1000型的基础上进行了改良，是首个真正优化了紫外光照射模式的交联仪，扩大了角膜交联效应区。UV-X2000型是国内标准交联法的主器。其主要改进包括:

(1) 优化的紫外光参数。设计者根据人角膜中央薄、周边厚的特点对紫外光光源进行了改良，使光源具备一定的“弧度”。1000型仪器的不足在于照射平面为水平，使得照射区周边有效深度较浅(图2-5A)。而UV-X2000的优化设计增加了对周边角膜紫外光照射深度，使得交联前后基质“分界线”基本与角膜后表面平行(图2-5B)。

(2) 更大的交联效应区。既然UV-X2000型交联仪增加了周边角膜的交联深度，则总的交联效应区明显增加，因此对生物力学特性的增加要优于UV-X1000型交联仪。

(3) 紫外光聚焦点可控。UV-X2000型交联仪增加了“四点光斑”式焦点调节模式，使术者能够快速、精确地调节照射高度，使交联效应发生于目标区的前部基质(图2-6和图2-7)。

(4) 更短的照射时间。高能量紫外光，强度增加至9mW/cm²，在总照射能量相同的情况下显著缩短了照射时间。

UV-X2000型交联仪的部分参数特点:

• 波长, (365±10)nm
• 平均强度, 9.0mW/cm²
• 标准照射距离, 4.5cm
• 照射模式, 连续式
• 照射时间, 10min
• 光斑直径, S挡7.5mm, M挡9.5mm
• 患者体位, 仰卧位
• 工作电压, 100~240V
• 发射器大小, 33cm×5cm×5cm
• 系统重量, 6.5kg, 光源重0.6kg

三、KXL加速交联系统

2010年，美国Avedro公司开始了其KXL加速交联系统的商品化(图2-8)。在KXL系统中，核黄素液预浸泡角膜10min，使前部150μm的角膜基质核黄素浓度高于0.04%，之后再进行高能量的紫外光照射，其能量3~45mW/cm²可调。由于其紫外光能量及总照射能量均可调节，因此医师可根据患者特点进行一定程度的调整权限。例如，以30mW/cm²照射3min达到总能量5.4J/cm²，或照射2min达到总能量3.6J/cm²，或以45mW/cm²能量照射160s达到7.2J/cm²的总能量。目前，尚未见使用KXL治疗进展期圆锥角膜或其他角膜扩张性疾病的正式报道。当前，KXL系统在世界范围内已有较多应用。而其后续产品KXLII系统也已在开发测试，创新重点在于角膜地形图引导的个性化交联设计和瞳孔追踪等新功能的引入。

KXL加速系统需要使用配套的Avedro核黄素产品，如VibeX Rapid为0.1%的加速扩散型核黄素，其不含右旋糖苷，扩散率是标准核黄素的2倍，用于去上皮后的交联，体现了KXL的加速交联理念。而Lasik Xtra为0.25%核黄素的等渗盐溶液，专用于屈光手术联合交联的LasikXtra手术过程。另外，Paracel是0.25%的透上皮型核黄素，直接应用于不去除上皮的跨上皮角膜交联。由于Paracel含苯扎氯铵、EDTA等促渗透剂，可使核黄素以最快的渗透速度到达角膜基质内。此时，若使用既往的低能量交联仪，则紫外光强度仍将被上皮大幅削弱，故使用Paracel时只有KXL的高能量(跨上皮交联时通常使用45mW/cm²的能量)模式能够满足交联需要。更重要的是，UV-X2000型角膜交联仪只能用于角膜厚度大于400μm的圆锥角膜患者。目前的部分研究数据表明，KXL系统的角膜厚度阀值为330μm左右，大大扩展了对圆锥角膜的适应证，拥有更广的临床应用前景。KXL的应用详见本书第七章。

KXL加速交联系统的特性:

• 波长, 365nm
• 平均强度, 3.0~45 mW/cm²
• 总照射能量, 一般为5.4 J/cm²或7.2 J/cm²
• 照射模式，连续式或脉冲式
• 照射时间, 依总能量及能量强度而定, 一般2～5 min
• 光斑直径，最大11mm
• 患者体位，仰卧位
• 电源，充电式
• 操作模式，LED触控屏，内置POS机微软系统，保证系统稳定、可靠，能记录所有患者的数据，提供可靠临床数据
• 对焦模式, 双十字对焦, 通过无线式手持调节杆调节焦点的X, Y, Z三轴
• 270°旋转光学头、超长手臂，可满足不同位置的治疗需要
• 气压式手臂固定装置，可使手臂固定在需要的高度，方便操作